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    藏紅花愈傷組織誘導和褐化抑制

    藏紅花愈傷組織誘導和褐化抑制

    袁麗紅 陸玉婷 黃晶

    南京工業大學學報(自然科學版)第31卷第6期 2009年11月

     

    摘要:對藏紅花的球莖、無菌芽和幼葉的愈傷組織誘導條件進行研究,同時探討愈傷組織誘導過程中的褐化和污染問題。結果表明:與球莖相比,以無菌芽和幼葉為外植體,愈傷組織誘導率較高,誘導時間較短,但形成的愈傷組織易褐化。較大球莖(≥20g)也是藏紅花愈傷組織誘導較好的外植體,愈傷組織誘導速度隨球莖儲藏時間的增加而升高。含有2.0mg/L 2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)和0.5mg/L 6-芐氨基嘌呤(6-BA)的MS(Murashige and Skoog)培養基有利于球莖愈傷組織的誘導,30d愈傷組織誘導率可達70%以上。在愈傷組織誘導過程中,連續轉接外植體至新鮮培養基可以有效降低褐化率,而在培養基中添加活性炭(AC)和聚乙烯吡咯烷酮(PVP)不能有效抑制褐化。表面滅菌前采用流水沖洗過夜可有效減少球莖表面附生菌,明顯降低污染率。

    關鍵詞:藏紅花;球莖;愈傷組織;誘導;褐化

     

    藏紅花(Crocus sativus L. , C. sativus)又名番紅花、西紅花,鳶尾科草本植物,原產于歐洲地中海地區,其干燥柱頭作為傳統名貴藥材,一直在臨床上廣泛使用。我國傳統中醫認為藏紅花性味甘平,入心、肝經,能活血化瘀,散郁開結,主治憂思郁結、胸膈痞悶、吐血、傷寒發狂、驚悸恍惚、婦女閉經、產后瘀血腹痛和跌撲腫痛等。此外,藏紅花作為一種珍貴調味劑、香料和染料在歐洲已經有幾百年的悠久歷史。現代醫藥學發現藏紅花在抗腫瘤、免疫調節以及抗心血管系統疾病等方面具有良好功效,尤其是在抗腫瘤方面功效顯著,藏紅花柱頭中藏紅花素、藏紅花苦素、藏紅花酸等活性成分都具有良好的抗腫瘤作用,其毒副作用明顯低于現常用抗腫瘤藥物。因此,藏紅花將成為抗腫瘤藥物研究開發的新熱點。

    傳統栽培條件下藏紅花主要以球莖繁殖,但球莖繁殖系數低,退化現象嚴重,導致藏紅花種源嚴重缺乏。藏紅花的有效成分主要集中于柱頭,由于藏紅花資源有限,柱頭產量也很低,其價格每kg高達2000美元左右,被譽為“植物黃金”。植物細胞工程的發展已經為很多植物的工業化生產提供了機會,同時也為解決藏紅花資源短缺問題提供了一條有效途徑。但離體條件下獲得的花柱柱頭狀物再生時間長,誘導頻率低,尤其柱頭狀物難以繼代培養,并容易褐化和死亡,不利于大規模生產,因此篩選快速生長并能產生藏紅花素、藏紅花苦素和藏紅花酸等藥理活性物質的愈傷組織和細胞系,利用植物細胞培養技術大規模生產藏紅花素等活性物質是解決藏紅花資源的有效方法之一。陳書安等以藏紅花芽、葉和花為外植體進行愈傷組織誘導和細胞系篩選工作,從229株細胞系中篩選出生長快、不易褐化細胞系Corm1,其藏紅花素1的含量為1677mg/g。郭志剛等也篩選出生長較快的藏紅花愈傷組織并通過二步培養法生物合成藏紅花素。此外, Julio等還發現藏紅花球莖誘導形成的愈傷組織能合成一種與球莖中相同的蛋白聚糖,可有效抑制人體癌細胞生長。

    篩選獲得生長能力強和代謝產物含量高的細胞系的關鍵是愈傷組織的誘導,但在此方面的研究報道較少。筆者以藏紅花球莖、芽及幼葉為外植體,研究不同誘導條件對愈傷組織誘導和形成的愈傷組織特征的影響,為大量培養藏紅花細胞的研究提供基礎。

     

    1 材料與方法

    1.1 材料

    藏紅花球莖采自上海崇明島。球莖大小按質量分為10g以下、10~20g和20g以上3個等級。不同生理狀態的球莖儲藏時間分別為3、30、70、100和150d。

    1.2 培養基

    MS(Murashige and Skoog)培養基,附加30g/L蔗糖,pH5.8;B5培養基,附加20g/L蔗糖,pH5.5。附加生長調節劑分別為:1)2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)2.0mg/L和6-芐氨基嘌呤(6-BA)0.25mg/L;2)2,4-D 30mg/L和6-BA 0.25mg/L;3)2,4-D 2.0mg/L和6-糠基氨基嘌呤(KT)0.5mg/L;4)萘乙酸(NAA)2.0mg/L和KT 0.5mg/L;5)2,4-D 2.0mg/L和6-BA 0.1mg/L;6)2,4-D 2.0mg/L和6-BA 0.5mg/L;7)2,4-D 1.0mg/L和6-BA 0.5mg/L;8)2,4-D 0.5mg/L和6-BA 0.5mg/L。其中1)~3)用于無菌芽和幼葉,1)~8)用于球莖。

    1.3 外植體表面滅菌與愈傷組織誘導

    剝去藏紅花球莖皮膜,將球莖洗凈或再將洗凈的球莖于流水下沖洗過夜,先用75%乙醇浸泡1min,再用0.1% HgCl2溶液表面滅菌6~15min,無菌水漂洗4次,用滅菌濾紙吸干球莖表面水分后切成0.5~1cm的小塊,接種于培養基中,于(21±0.5)℃下黑暗培養。

    球莖表面滅菌后切下芽點,置于適宜的培養基上萌發形成無菌芽,以無菌芽直接作為誘導愈傷組織誘導材料,將無菌芽切成0.5~1cm的小段,接種于培養基上培養。

    藏紅花球莖置于光照培養箱內,每天光照10h,21℃下花芽萌發形成4~6cm幼葉作為外植體,滅菌方法同上。去掉花芽外表皮后,切成0.5~1cm的小段,接種于培養基上培養。

    1.4 抗褐化試劑

    1)活性炭(AC)1.0mg/L

    2)聚乙烯吡咯烷酮(PVP)1.0mg/L

    1.5 數據統計和分析

    愈傷組織誘導率=形成愈傷組織的塊數/接種塊數×100%

    愈傷組織污染率=污染塊數/接種塊數×100%

    愈傷組織褐化率=褐化的愈傷組織塊數/接種塊數×100%

    對實驗數據進行統計分析,分析時將百分數轉換成反正弦值,實驗均重復2次;p≤0.05,凡標相同字母的表示差異不顯著(分別用a、b、c、d、e和f表示),標不同字母的表示差異顯著。

     

    2 結果與討論

    2.1 表面滅菌方法對外植體滅菌效果的影響

    文獻報道以球莖為外植體其表面滅菌方法是球莖洗凈后于75%乙醇浸泡1min,再用0.1% HgCl2溶液處理15min。但由于球莖生長于土中,其表面帶有大量微生物,因此選擇合適的表面滅菌方法對愈傷組織誘導極其重要。為了減少附生菌數量,提高消毒效果,本研究將球莖洗凈后先在流水下沖洗過夜,然后再進行表面滅菌,該滅菌方式對球莖滅菌效果和愈傷組織誘導情況影響結果如表1所示。

     

    表1 表面滅菌方法對藏紅花外植體滅菌效果的影響

    表1 表面滅菌方法對藏紅花外植體滅菌效果的影響

     

    表1表明,采用文獻報道的處理方法,愈傷組織誘導過程中外植體污染率高達288%,并且污染微生物主要生長于球莖表面,說明附生于球莖表面的微生物并未被完全殺死。而采用滅菌前先流水沖洗,外植體組織塊污染率顯著降低,只有56%,說明表面滅菌前用流水沖洗可明顯減少球莖表面的附生菌,愈傷組織誘導率也有明顯提高。進一步考察HgCl2處理時間對滅菌效果及愈傷組織誘導率的影響,結果發現縮短滅菌時間,污染率明顯升高,愈傷組織誘導率顯著降低。可見,球莖有效的表面滅菌方法是先用流水沖洗過夜再用0.1% HgCl2處理15min。

    2.2 藏紅花不同外植體愈傷組織誘導差異

    以球莖、花芽中幼葉和無菌芽為外植體,分別接種于附加不同生長調節劑配比的MS培養基中,愈傷組織誘導情況如表2所示。

     

    表2 藏紅花不同外植體愈傷組織誘導的差異

    表2 藏紅花不同外植體愈傷組織誘導的差異

     

    藏紅花不同外植體愈傷組織形成時間和誘導率不同。芽和幼葉較容易誘導出愈傷組織,接種11d左右,芽的周圍可見明顯的淡黃色或半透明愈傷組織,幼葉邊緣向上卷曲,在切口周圍有白色或半透明愈傷組織形成。而球莖愈傷組織發生時間較晚,20d左右時在鱗片表面、芽眼處和切口處方見白色或黃色愈傷組織形成。另外,愈傷組織誘導率與生長調節劑組合及濃度配比有關,芽和幼葉的誘導率較高,在2.0mg/L 2,4-D和0.25mg/L 6-BA生長調節劑組合中芽的誘導率最高可達72.1%,較高生長素濃度3.0mg/L 2,4-D和0.25mg/L 6-BA的生長調節劑組合對幼葉愈傷組織誘導效果最好,2.0mg/L 2,4-D和0.25mg/L 6-BA生長調節劑組合也適合誘導球莖愈傷組織。

    不同外植體誘導形成的愈傷組織如圖1所示,盡管芽和幼葉愈傷組織誘導率較高,但是愈傷組織性狀不穩定,芽誘導出的愈傷組織剛開始生長旺盛,較柔軟,呈半透明狀,但在誘導培養過程中愈傷組織顏色逐漸加深為橙黃色,生長速度變慢,部分愈傷組織容易褐化。幼葉誘導產生的大部分愈傷組織較為堅硬,生長速度極為緩慢,容易褐化,部分愈傷組織膨大物形成棉花狀愈傷組織,無法繼續培養。球莖誘導的愈傷組織質地較芽和幼葉愈傷組織致密疏松,剛開始為乳白色或者淺黃色,在誘導培養過程中愈傷組織顏色逐漸加深呈淡黃色,部分顏色變為橙紅色或紅色,仍能保持良好的生長趨勢。因此,誘導培養過程中,選擇球莖為外植體可得到性狀較好的愈傷組織。

     

    圖1 藏紅花不同外植體誘導形成的愈傷組織

    圖1 藏紅花不同外植體誘導形成的愈傷組織

     

    2.3 基本培養基對愈傷組織誘導的影響

    將球莖外植體分別接種于附有不同濃度6-BA的MS和B5 2種培養基中,考察培養基類型對愈傷組織誘導效果的影響,結果如表3所示。由表3可知,不同基本培養基對藏紅花球莖愈傷組織誘導效果存在顯著差異且愈傷組織誘導率與生長調節劑組合也具有一定相關性。隨著分裂素6-BA濃度的增加均有愈傷組織誘導率升高的趨勢。相同生長調節劑水平下,MS更有利于愈傷組織的誘導,MS培養基中愈傷組織誘導率較高,愈傷組織長勢良好,生長速度較快;而在B5培養基中形成的愈傷組織不僅誘導率低,生長速度慢而且容易褐化。這與培養基的營養成分有一定關系,MS培養基中無機養分的數量和比例均較合適,與B5培養基成分相比,MS培養基中的硝酸鹽和銨的含量較高,更有利于藏紅花球莖愈傷組織的誘導,故以MS為基本培養基。

     

    表3 不同基本培養基對藏紅花愈傷組織誘導的影響

    表3 不同基本培養基對藏紅花愈傷組織誘導的影響

     

    2.4 不同生長調節劑組合及濃度配比對愈傷組織誘導的影響

    從以上實驗可以看出,生長調節劑對藏紅花愈傷組織的誘導具有一定的影響。以藏紅花球莖為外植體,進一步考察不同生長調節劑組合及濃度配比對愈傷組織發生時間及誘導率的影響,結果如表4所示。由表4可見,生長調節劑組合及濃度配比對愈傷組織的發生時間和誘導率都有明顯影響,相同生長調節劑濃度條件下,2,4-D和6-BA組合最有利于球莖愈傷組織的誘導,NAA和KT、2,4-D和KT組合盡管能誘導出愈傷組織,但愈傷組織誘導率低,誘導培養過程中生長活性低,易褐化。進一步考察2,4-D與6-BA不同濃度配比對愈傷組織誘導的影響,發現2,4-D與6-BA不同濃度的配比對愈傷組織誘導有顯著影響。2,4-D濃度不變時,愈傷組織誘導率隨6-BA濃度減少逐漸下降;當6-BA濃度不變,過高或過低濃度的2,4-D都不利于球莖愈傷組織的誘導。因此,選擇相對適合濃度的外源生長調節劑組合是誘導愈傷組織的關鍵。在本實驗中2.0mg/L 2,4-D和0.5mg/L 6-BA組合愈傷組織誘導率最高,且愈傷組織生長速度較快,不易褐化。

     

    表4 不同生長調節劑組合及濃度對藏紅花愈傷組織誘導的影響

    表4 不同生長調節劑組合及濃度對藏紅花愈傷組織誘導的影響

     

    2.5 球莖大小和生理狀態對愈傷組織誘導的影響

    球莖作為藏紅花的營養根,其大小與后期葉的生長和開花都有一定相關性,球莖越大,生長期發葉越多,開花率越高。本實驗也考察了不同大小的球莖愈傷組織誘導的影響。將藏紅花球莖按質量分為10g以下、10~20g和20g以上3個等級,結果見表5。由表5可知,隨著球莖質量的增加,愈傷組織誘導率提高。這可能由于較大的球莖積累了較充足的養分,為愈傷組織誘導和生長提供足夠營養,從而愈傷組織形成能力也較強。因此,較大球莖更適合作為誘導愈傷組織的材料。

     

    表5 球莖大小對藏紅花愈傷組織誘導的影響

    表5 球莖大小對藏紅花愈傷組織誘導的影響

     

    不同生理狀態的球莖其愈傷組織發生和誘導也具有一定的差異,結果見表6。由表6可知,隨球莖儲藏時間的延長,愈傷組織發生時間提前,誘導能力逐漸增強。儲藏時間小于60d時球莖處于休眠期,此時其對外源的生長調節劑敏感性低,愈傷組織發生遲,生長速度慢,誘導過程較長。球莖儲藏80d左右,花芽開始萌動,其內源激素開始變化,球莖對外源生長調節劑敏感性提高,對生長物質的吸收明顯加速,所以愈傷組織發生早,生長速度快,短時間內就可以得到較高的誘導率。

     

    表6 球莖生理狀態對藏紅花愈傷組織誘導的影響

    表6 球莖生理狀態對藏紅花愈傷組織誘導的影響

     

    2.6 褐化的減輕和控制

    在以藏紅花球莖為外植體誘導愈傷組織過程中,在切開的傷口處極易褐化,導致培養基顏色呈深紅色,影響愈傷組織的形成,即使形成愈傷組織褐化較輕,但隨著時間延長,愈傷組織也逐漸褐化,并可造成愈傷組織死亡。因此,在藏紅花愈傷組織誘導中減輕和控制褐化是一項重要研究工作。文獻報道了在培養基中添加吸附劑或連續轉移易于褐變的外植體材料都能有效抑制褐變。在培養基中分別添加1g/L的AC和1g/L的PVP考察球莖愈傷組織誘導率及褐化率的差異(表7),結果發現球莖外植體嚴重褐化并死亡,愈傷組織誘導率為0。而采用連續轉移外植體至新鮮培養基的方法,褐化程度明顯減輕,愈傷組織誘導率也有所提高。這由于將外植體轉移到新鮮的培養基上生長這段時間內,外植體傷口愈合,外滲停止,在一定程度上可以緩解褐化,因此連續轉接可以作為球莖愈傷組織誘導控制褐化的有效方法。

     

    表7 不同處理方法對藏紅花球莖愈傷組織褐化的影響

    表7 不同處理方法對藏紅花球莖愈傷組織褐化的影響

     

     

    3 結論

    藏紅花不同外植體愈傷組織形成時間和誘導率是不同的。以無菌芽和幼葉為外植體,誘導率較高,誘導時間較短,但形成的愈傷組織易褐化,而以球莖為外植體可得到性狀較好的愈傷組織。含有2mg/L 2,4-D和0.5mg/L 6-BA的MS培養基有利于球莖愈傷組織的誘導,30d愈傷組織誘導率可達70%以上。同時,球莖由于大小及生理狀態的不同,其愈傷組織發生與誘導都存在一定差異,較大(≥20g)或儲藏時間較長的球莖愈傷組織形成時間較早,形成能力強。在愈傷組織誘導過程中采用連續轉接外植體至新鮮培養基的方法可以有效降低褐化率,而在培養基中加入活性炭AC和聚乙烯吡咯烷酮PVP不能有效抑制褐化。此外,表面滅菌前采用流水沖洗過夜可有效減少球莖表面附生菌,明顯降低污染率。

     

    Callus induction and browning inhibition of Crocus sativus L.

    YUAN Li-hong, LU Yu-ting, HUANG Jing

     

    Abstract: Callus induction from corms, sterile buds and young leaves of Crocus sativus L. was studied, and the browning and contamination in the callus induction were also explored. Results indicated that with the sterile buds and young leaves as explants, the percentage of callus inducement was higher and the inducing time was shorter than that with corms as explants, but the browning took place easily in callus. The bigger corms (≥20g) were suitable for the callus induction. Moreover, the longer corms were stored, and the faster calli were induced. The percentage of callus inducement was over 70% within 30d by using Murashige and Skoog (MS) medium supplemented with 2.0mg/L 2,4-D and 0.5mg/L 6-BA. Inoculating explants to fresh media in succession could effectively reduce the browning, whereas media with the addition of activated carbon and polyvinylpyrrolidone were ineffective to diminish the browning. Washing corms with running tap water overnight before sterilization were effective for reducing surface epiphytic microorganisms significantly and depressing the rate of contamination.

    Keywords: Crocus sativus L. ; corm ; callus ; induction ; browning


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    標簽:藏紅花 球莖 大學 愈傷組織 組織培養

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