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    藏紅花素誘導宮頸癌HeLa細胞凋亡及其作用機制

    藏紅花素誘導宮頸癌HeLa細胞凋亡及其作用機制
    Effect and mechanism of HeLa cell apoptosis induced by crocin

     

    出處:中華腫瘤防治雜志2009年10月第16卷第19期

    作者:龔青、石丁波、蔡衛斌、楊中漢、譚維格、廖彩韻、彭超、劉暢、高國全、楊霞(中山大學中山醫學院生物化學教研室 廣東廣州 510080)

    目的:研究藏紅花素對HeLa細胞的促凋亡作用和機制。

    方法:設置0、0.2、0.4及0.8mmol/L 4個濃度梯度,MTT法分析不同濃度藏紅花素對HeLa細胞增殖的影響;設置空白陰性對照及秋水仙素(10μg/L)陽性對照,向HeLa細胞培養物分別加入0.4和0.8mmol/L 的藏紅花素,培養48h后用PI/Annexin V雙染法分析其凋亡情況;1.6mmol/L 藏紅花素作用于HeLa細胞72 h后,蛋白質印跡法檢測Caspase-3的切割。結果:MTT實驗分析顯示,在0、0.2、0.4及0.8mmol/L 濃度下HeLa細胞存活率分別為1、0.964、0.796和0.586。藏紅花素顯著地抑制HeLa細胞生長,P<0.05;各濃度組間均差異有統計學意義,P<0.05。PI/Annexin V雙染法、流式細胞儀檢測顯示,陰性對照組、10μg/L秋水仙素陽性對照組、0.4 及0.8mmol/L藏紅花素處理組的細胞凋亡率分別為3.64%、15.99%、4.86%和9.28%,藏紅花素促進HeLa細胞凋亡。蛋白質印跡法檢測顯示,藏紅花素促進HeLa 細胞Caspase-3切割。

    結論:藏紅花素可明顯地抑制HeLa細胞生長,并通過增加HeLa細胞Caspase-3切割促進其凋亡。

     

    藏紅花(Crocus sativas L.)是鳶尾科番紅花屬球根類草本植物,自古便是活血化瘀的良藥。最新研究發現,藏紅花還具有廣譜抗癌活性,對白血病、卵巢癌、結腸癌、膀胱癌、橫紋肌肉瘤、乳頭肉瘤、扁平細胞瘤和軟組織肉瘤等都具有較強的抑制作用,而且毒性較小。藏紅花素(crocin)是藏紅花最主要的一種色素,對多種癌細胞均有明顯抑制作用,且與其他常用抗癌藥物配合使用,可降低這些藥物的毒副反應,改善療效。目前對于藏紅花素抑癌機制的研究表明,其有多種可能的作用通路,其中細胞凋亡路徑得到了較多的研究支持。本研究旨在對藏紅花素促HeLa細胞凋亡的作用進行研究,并初步探討其誘導細胞凋亡的機制。

     

    1 材料與方法

    1.1 藥物與試劑

    藏紅花素和MTT購自美國Sigma公司,20mg藏紅花素加12.5mg EDTA溶于4mL三蒸水,配成濃度為50mmol/L的母液,儲存于4℃;RPMI1640培養基和胎牛血清購自美國Gibco公司。Annexin V-FITC Apoptosis Detection Kit購自Bender Medsystens公司(凱基生物)。Caspase-3抗體購自Sant公司。

    1.2 細胞系

    HeLa細胞株可連續傳代,將細胞培養于含10%胎牛血清的RPMI1640培養基中,長滿后0.25%胰蛋白酶消化傳代。

    1.3 主要儀器

    包括超凈工作臺、二氧化碳培養箱和HITACHI分光光度儀。

    1.4 MTT法

    取對數生長期的HeLa細胞,進行細胞計數,用細胞培養液調整細胞密度為2×104 個/mL 接種到12孔平板,每孔為2 mL,將平板置于37℃、5% CO2飽和濕度培養箱中培養,細胞貼壁后,吸出上清,加入含藏紅花素的無血清培養液2mL,使得HeLa細胞藏紅花素的濃度為0、0.2、0.4和0.8mmol/L,待檢樣品繼續培養48 h。在實驗終止前4 h加MTT(5 g/L)200μL/孔,繼續孵育4h,吸出上清液,每孔加入1mL DMSO,搖勻,待Formazan溶解后,分光光度計在570nm處測OD值。實驗中每份樣品設3個復孔。用各個濃度的OD吸收值平均值除以對照組的OD吸收值,得出細胞存活曲線。

    1.5 PI/Annexin V雙染法

    將對數生長期的細胞用含有10% 胎牛血清的RPMI1640培養液重懸,調整細胞濃度加入6孔培養板中繼續培養,當細胞達到60%~70%融合時加入以無血清培養液配制的濃度為0.4和0.8mm/L 的藏紅花素,陰性對照組為等量無血清培養液,陽性對照組為秋水仙素(10μg/L)。培養箱中繼續培養48h后,0.25%胰蛋白酶消化制成細胞懸液,進行PI/Annexin V雙染,流式細胞儀測定凋亡指數,進而分析確定藏紅花素對HeLa細胞的凋亡作用。

    1.6 蛋白質印跡法

    SDS細胞裂解液收集藥物處理24h的HeLa細胞,冰上超聲1min,煮沸10min,10000r/min(r=10.3cm)離心15min,取上清液,行蛋白定量分析,然后進行SDS-PAGE電泳,再將其轉移到PVDF膜上,脫脂牛奶封閉1h,加入1:1000 稀釋的兔抗人切割Caspase-3抗體,4℃孵育過夜,再加入1:1000稀釋的羊抗兔IgG 抗體,室溫孵育2h,ECL顯色,曝光。

    1.7 統計學方法

    所有數據用x±s表示,通過SPSS11.0 軟件完成。采用方差分析,并用最小有意義差異狋檢驗(Least significant difference-t,LSD-t)進行均數間的多重比較,檢驗水準α=0.05。

     

    2 結果

    2.1 藏紅花素對HeLa細胞增殖的抑制作用

    在0.4 mmol/L 的濃度下,藏紅花素處理組與對照組細胞相比呈現下降趨勢(P<0.05),且其抑制作用表現為濃度依賴性(圖1)。各組HeLa細胞生存率間差異有統計學意義,P<0.05。

     

    藏紅花素對HeLa細胞生存率的影響

    圖1 藏紅花素對HeLa細胞生存率的影響 ※vs空白對照組,P<0.05;※※vs空白對照組,P<0.01

     

    2.2 藏紅花素對HeLa細胞凋亡的誘導作用

    用藏紅花素處理過的HeLa細胞收縮,細胞質減少,胞質出現空泡狀區域,并出現核固縮(圖2)。流式細胞儀檢測證實,藏紅花具有誘導HeLa細胞凋亡的作用(圖3)。陰性對照組凋亡率為3.64%,10μg/L秋水仙素陽性對照組為15.99%,0.4mmol/L 藏紅花素處理組為4.86%,0.8 mmol/L 藏紅花素處理組為9.28%。結果表明,藏紅花素具有誘導HeLa細胞凋亡的作用。

    2.3 藏紅花素對HeLa細胞Caspase-3激活的促進作用

    0.4、0.8mmol/L 藏紅花素作用HeLa細胞24h后,蛋白質印跡法檢測Caspase-3切割條帶的變化,藏紅花素能促進HeLa 細胞Caspase-3 蛋白的切割(圖4)。提示藏紅花素誘導HeLa 細胞凋亡過程中Caspase-3被激活。

     

    藏紅花素誘導HeLa細胞凋亡

    圖2 藏紅花素誘導HeLa細胞凋亡(×400) A:正常HeLa細胞;B:藏紅花素處理的HeLa細胞;C:秋水仙素處理的HeLa細胞

     

    藏紅花素誘導HeLa細胞凋亡

    圖3 藏紅花素誘導HeLa細胞凋亡 1:空白對照;2:0.4mmol/L藏紅花素處理組;3:0.8mmol/L 藏紅花素處理組;4:10μg/L秋水仙素陽性對照組

     

    藏紅花素對HeLa細胞Caspase-3的激活作用

    圖4 藏紅花素對HeLa細胞Caspase-3的激活作用 1:對照;2:0.4mmol/L藏紅花素作用HeLa細胞24h后,Caspase-3切割條帶的變化;3:0.8mmol/L 藏紅花素作用HeLa 細胞24 h后,Caspase-3切割條帶的變化

     

    3 討論

    藏紅花廣泛分布于伊朗、西班牙、法國以及希臘等地,印度、日本也有栽培,經印度傳入我國西藏,因此稱為藏紅花。近年來,傳統中藥的多靶點作用機制、較少不良反應等優點表現出誘人的應用前景,篩選出高效低毒的抗腫瘤中藥是研究熱點之一。

    藏紅花的有效成分主要包括產生苦味的物質以及多種色素,而后者對藏紅花的療效有著更為重要的意義。藏紅花素是藏紅花最主要的一種色素,由藏紅花酸(crocetin)糖基化形成,是極其少見的水溶性類胡蘿卜素。其特殊的水溶性及其對癌細胞強有力的抑制作用,使其成為了藏紅花色素中更有望應用于癌癥治療的成分。用藏紅花素處理過的HeLa細胞收縮,細胞質減少,胞質出現空泡狀區域,并出現核固縮,這些都是藏紅花素引起HeLa細胞凋亡的形態學證據,與文獻報道相符。本研究通過MTT法和PI/Annexin雙染法等方法證實了這一凋亡作用的存在。然而藏紅花素誘導HeLa細胞凋亡的信號通路尚不明確。

    研究證實,藏紅花素對多種癌細胞均有明顯抑制作用,且在與其他常用抗癌藥物配合治療過程中,可降低抗癌藥順鉑等的毒副反應,改善療效。目前對于藏紅花素抑癌機制的研究表明,其有多種可能的作用通路,其中細胞凋亡路徑得到了較多的研究支持。我們對藏紅花素促HeLa細胞凋亡的作用進行了研究,并初步探討其誘導細胞凋亡的機制。

    Caspase-3是CPP32亞家族成員之一,是新近予以關注的Caspase家族中最重要的凋亡執行者之一,它被合成后通常以非活化的酶原形式存在于細胞質中,在多種凋亡信號刺激下經蛋白水解作用被激活成活化形式,可對多種蛋白底物進行降解,從而在細胞凋亡過程中起關鍵作用,被認為是整個凋亡級聯反應的一個關鍵調節點。本研究證實,藏紅花素能促進HeLa細胞Caspase-3蛋白的切割,提示藏紅花素誘導HeLa細胞凋亡過程中Caspase-3被激活。

    本研究對藏紅花素誘導HeLa細胞凋亡的機制進行了初步研究,該途徑上游通路還有待進一步研究。


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