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    藏紅花胚性愈傷組織的發生及其調控

    藏紅花胚性愈傷組織的發生及其調控

    陳書安 王曉東 趙兵 王玉春

    過程工程學報第7卷第1期 2007年2月

     

    摘要:為提高藏紅花胚性愈傷組織的繁殖系數和出芽率,促進其生長和分化,以建立藏紅花離體快繁體系,解決藏紅花資源短缺問題,研究了藏紅花胚性愈傷組織的發生及其調控。結果表明,獲得的藏紅花球莖1細胞系具有良好的胚性愈傷組織發生能力。胚性愈傷組織生長的優化條件為:在添加3.0mg/L 6-BA,0.25mg/L NAA和400mg/L CH的B5固體培養基上,22℃下全時暗培養25d,繁殖系數達到9g/g。胚性愈傷組織出芽的優化條件為:在添加3.0mg/L 6-BA,0.25mg/L NAA和400mg/L CH的1/2 B5固體培養基上,在22℃及光照強度31.74μmol/(m2⋅s)條件下,每天光照10h,暗培養14h,培養45d出芽率達到44.7%,高于國外報道的20%。

    關鍵詞:藏紅花;胚性愈傷組織;快繁體系;出芽能力

     

    1前言

    藏紅花(Crocus sativus L.)是一種名貴的傳統婦科良藥,其柱頭中含有的藏紅花素、藏紅花苦素等活性成分具有良好的抗癌作用,能夠從分子水平上抑制腫瘤的形成,有望成為21世紀最理想的抗癌藥物之一,還可用于功能性食品和保健性化妝品的開發。但藏紅花資源極其有限,價格昂貴,$2000/kg 左右,被譽為“植物黃金”。通過植物細胞工程建立藏紅花快繁體系是解決藏紅花資源短缺的有效途徑之一。

    胚性愈傷組織具有親本的遺傳特性,不論在離體快繁、種質保藏、細胞工程、遺傳轉化,還是在細胞水平上的生理生化、原生質體、離體誘變等研究方面都具有獨特應用,可以作為種質保藏、理化或自發誘變和遺傳轉化的理想材料,還可制作人工種子或建立無病毒苗的快繁體系,又可用于生理生化及體細胞胚調控的研究,建立良好的原生質體培養體系。

    為建立藏紅花的快繁體系,國內外誘導了藏紅花胚性愈傷組織,并初步優化了培養條件,促使胚性愈傷組織分化成藏紅花芽。但其生長和分化條件缺少系統優化,且愈傷生長緩慢,出芽率低,國內報道為1%,國外報道也未超過20%,這限制了藏紅花快繁體系的建立。在獲得藏紅花球莖1細胞系的研究基礎上,本研究通過誘導球莖1細胞系獲得藏紅花胚性愈傷組織,并優化了胚性愈傷組織生長和分化的條件,以提高其增殖系數和分化能力,為建立高效穩定的藏紅花再生體系奠定了基礎。

     

    2 材料和方法

    2.1材料

    藏紅花愈傷組織球莖1細胞系(黃色,質地疏松,不透明),本實驗室誘導和篩選。

    2.2 培養基

    MS,LS,B5,White和N6培養基。

    2.3 胚性愈傷組織的發生及其過程優化方法

    將藏紅花愈傷組織接種在添加0.25mg/L 2,4-D(2,4-Dichlrophyenoxy acetic acid),2.0mg/L 6-BA(6-Benzyladenine)和200mg/L CH(Casein Hydrolysate,水解酪蛋白)的MS固體培養基上,21℃全時暗培養,觀察胚性愈傷組織的發生。

    胚性愈傷組織的生長和分化優化均采取單因素法,即將上一個因素的優化結果直接應用到下一個因素的優化實驗中。

    實驗的光照條件若沒有特殊指明,均為在31.74μmol/(m2⋅s)的光照強度下,每天光照10h,暗處理14h。

    2.4 胚性愈傷組織的干重和鮮重測定方法

    從三角瓶中取出藏紅花愈傷組織,以濾紙吸凈表面水,稱重即得鮮重。在60℃烘干至恒重,稱重為干重。

    2.5 胚性愈傷組織出芽率的統計

    將鮮重2.5g的胚性愈傷組織均等分為10份,接種于盛有40mL 1/2 固體培養基的100mL 三角瓶中,在優化條件下培養45d,統計出芽率。

     

    2.6 胚性愈傷組織繁殖系數的計算

     

    3 結果與分析

    3.1藏紅花胚性愈傷組織的獲得

    胚性愈傷組織的誘導比一般愈傷組織誘導難度較大,常添加硝酸銀,或通過篩選、雜交、轉基因等方法獲得。從229 株細胞系中篩選出的球莖1細胞系藏紅花素1含量高(1.67mg/g)、生長快、不易褐化。通過條件實驗,獲得了胚性愈傷組織的誘導條件為:將0.6g藏紅花愈傷組織接種在添加0.25mg/L 2,4-D,2.0mg/L 6-BA和200mg/L CH的MS固體培養基上,21℃全時暗培養45d后,部分愈傷組織可形成胚性愈傷組織,挑取胚性愈傷組織,顏色為白色,質地堅硬,半透明狀。藏紅花胚性愈傷組織的照片見圖1(a)。

     

    藏紅花胚性愈傷組織分化成芽的各個階段

    藏紅花胚性愈傷組織分化成芽的各個階段

     

    3.2 激素對藏紅花胚性愈傷組織生長和出芽率的影響

    較低濃度的生長素和高濃度的細胞分裂素有利于胚性愈傷組織出芽,但濃度過高也會導致其老化死亡。低濃度NAA(Naphthalene Acetic Acid)和高濃度6-BA常用于胚性愈傷組織的生長和分化。將0.6g胚性愈傷組織接種在添加了200mg/L CH和不同種類與濃度的植物激素的MS固體培養基上,全時暗培養25d,測量其生物量和繁殖系數。將鮮重2.5g的胚性愈傷組織均等分為10 份接種于添加了200mg/L CH和不同種類與濃度的植物激素的1/2 MS固體培養基上,21℃光照條件下培養45d,統計出芽率。植物激素對胚性愈傷組織生長和出芽率的影響見表1。

     

    激素對藏紅花胚性愈傷組織生長和出芽率的影響

    表1 激素對藏紅花胚性愈傷組織生長和出芽率的影響

     

    表1表明,3.0mg/L 6-BA和0.25mg/L NAA的組合最有利于藏紅花胚性愈傷組織的增殖和出芽,其繁殖系數和出芽率分別達到5.8g/g和37.5%,生物量也達到最高,為5.5g/L(干重),因此以后胚性愈傷組織生長和出芽的條件都是添加3.0mg/L 6-BA和0.25mg/L NAA。胚性愈傷組織分化成芽的照片見圖1(b),1(c)。

    3.3 基本培養基對胚性愈傷組織生長和出芽率的影響

    將0.6g胚性愈傷組織接種在B5,LS,MS,N6和White基本固體培養基上,并均添加200mg/L CH,3.0mg/L 6-BA和0.25mg/L NAA,21℃全時暗培養25d,計算其生物量和繁殖系數。將2.5g胚性愈傷組織接種在不同的1/2上述5種基本固體培養基上,并均添加200mg/L CH,3.0mg/L 6-BA和0.25mg/L NAA,21℃光照條件下培養45d,統計其出芽率。基本培養基對胚性愈傷組織生長和出芽率的影響見表2,表明B5和1/2 B5固體培養基分別最適合胚性愈傷組織的生長和分化,胚性愈傷組織的繁殖系數、生物量(干重)和出芽率分別達到6.6g/g,7.0g/L和38.5%,因此在后續實驗中均采用B5和1/2 B5固體培養基分別繁殖和分化藏紅花胚性愈傷組織。

     

    表2 基本固體培養基對胚性愈傷組織生長和出芽率的影響

    表2 基本固體培養基對胚性愈傷組織生長和出芽率的影響

     

    3.4 溫度和光照對藏紅花胚性愈傷組織生長和出芽率的影響

    將0.6g胚性愈傷組織接種在添加200mg/L CH的B5固體培養基上,并均添加3.0mg/L 6-BA和0.25mg/LNAA,在不同溫度,或黑暗或光照條件下培養25d,計算其生物量和繁殖系數。將2.5g胚性愈傷組織接種在添加200mg/L CH的1/2 B5固體培養基上,并均添加3.0mg/L 6-BA和0.25mg/L NAA,在不同溫度,或黑暗或光照條件下培養45d,統計其出芽率。不同溫度與光照條件對胚性愈傷組織生長和出芽率的影響見表3。

     

    表3 溫度和光照對藏紅花胚性愈傷組織生長和出芽率的影響

    表3 溫度和光照對藏紅花胚性愈傷組織生長和出芽率的影響

     

    光照與溫度是影響胚性愈傷組織生長和分化的重要環境因子,通常暗培養有利于胚性愈傷組織發生、生長和保持,光照對胚性愈傷組織生長不利。本實驗中,在相同的溫度下,光照處理的胚性愈傷組織與全時暗培養的相比,其生物量和繁殖系數都較低,但出芽率高,這表明光照不利于藏紅花胚性愈傷組織的生長和增殖,但有利于其分化出芽,因此在以后的實驗中胚性愈傷組織的增殖是在全時暗培養下,而胚性愈傷組織的分化出芽是在光照條件下進行。

    培養溫度是影響胚性愈傷組織發生和生長的關鍵因素,還決定了胚性愈傷組織的分化能力,例如當溫度超過30℃,一些胚性愈傷組織將會永久失去體細胞胚胎發生能力。在實驗的5種溫度下,最適合胚性愈傷組織增殖的溫度是22℃,在此溫度下培養25d,胚性愈傷組織的生物量(干重)達到7g/L,繁殖系數為6.7g/g;最適合胚性愈傷組織分化和出芽的溫度也是22℃,在此溫度下光照培養45d,出芽率達到45.5%。隨著溫度的升高,胚性愈傷組織容易褐化,出芽率也隨之降低,因此在以后的實驗中均在22℃繁殖和分化藏紅花胚性愈傷組織。

    3.5 CH對藏紅花胚性愈傷組織生長和出芽率的影響

    將0.6g胚性愈傷組織接種在添加不同濃度CH的B5固體培養基上,并均添加3.0mg/L 6-BA和0.25mg/L NAA,22℃全時暗培養25d,計算其生物量和繁殖系數。將2.5g胚性愈傷組織接種在添加不同濃度CH的1/2 B5固體培養基上,并均添加3.0mg/L 6-BA和0.25mg/L NAA,在22℃光照條件下培養45d,統計出芽率。CH對胚性愈傷組織生長和出芽率的影響見表4。

     

    表4 水解酪蛋白對胚性愈傷組織生長和出芽率的影響

    表4 水解酪蛋白對胚性愈傷組織生長和出芽率的影響

     

    水解酪蛋白常作為一種有機添加物促進胚性愈傷組織的發生和生長。表4 表明,水解酪蛋白對胚性愈傷組織的生長、分化和出芽率都有一定的促進作用,當其添加濃度為400mg/L時,胚性愈傷組織的生物量(干重)達到8.7g/L,繁殖系數為9g/g,分別是不添加水解酪蛋白處理組的212%和209%;胚性愈傷組織的出芽率達到44.7%,是對照組(不添加水解酪蛋白)的127%,因此選擇400mg/L為CH的初始添加濃度。

     

    4 結論

    (1) 以高產藏紅花素的球莖1細胞系為材料,誘導并獲得了藏紅花胚性愈傷組織。

    (2) 胚性愈傷組織生長的優化條件為:在添加3.0mg/L 6-BA,0.25mg/L NAA和400mg/L CH的B5固體培養基上,22℃下全時暗培養25d,繁殖系數達到9g/g。

    (3) 胚性愈傷組織出芽的優化條件為:在添加3.0mg/L 6-BA,0.25mg/L NAA和400mg/L CH的1/2 B5固體培養基上,在22℃及光照強度31.74μmol/(m2⋅s)下,每天光照10h,暗培養14h,培養45d后出芽率達到44.7%,高于國外報道的20%。

     

    Induction and Regulation of Crocus sativus L. Embryogenic Callus

    CHEN Shu-an, WANG Xiao-dong, ZHAO Bing, WANG Yu-chun

    Abstract: The induction and regulation of embryogenic callus were investigated to promote the growth and shoot induction rate for micropropagation of Crocus sativus L. The embryogenic callus line was obtained easily from one corm callus line (corm 1). After 25d, the maximum proliferation rate of callus reached 8.9g/g under the optimized condition for cell growth when the callus was cultured on B5 medium supplemented with 400mg/L CH, 0.25mg/L NAA and 3.0mg/L 6-BA at 22℃ in darkness. After 45d, the maximum shoot induction rate of callus reached 45% under the optimized condition for shoot induction when the callus was cultured on 1/2 B5 medium supplemented with 400mg/L CH, 0.25mg/L NAA and 3.0mg/L 6-BA at 22℃ under 16h light with the intensity of 31.74μmol/(m2⋅s) per day, while the highest shoot induction rate of Crocus sativus L. callus was reported only about 20% abroad.

    Key words: Crocus sativus L.; embryogenic callus; micropropagation; shoot induction rate


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    標簽:藏紅花 愈傷組織 組織培養

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