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    西紅花苷-1對急性低氧條件下大鼠學習記憶及海馬SIRT1表達的影響

    西紅花苷-1對急性低氧條件下大鼠學習記憶及海馬SIRT1表達的影響
    Effect of crocin-1 on learning, memory, and expression of SIRT1 in hippocampus of rats under acute hypoxia

    本研究發表于中草藥期刊2013年5月第44卷第10期,文章編號:0253-2670(2013)10-1314-04。DOI:10.7501/j.issn.0253-2670.2013.10.021。

    作者和單位

    張曉巖1,喻 靜2,張先鈞1,賈 煒1,蒲小燕1,梁 宏1
    1.青海大學醫學院 基礎醫學部,青海 西寧 810001
    2.日本東京大學 醫學系研究科,日本 東京 113-8655

    中文摘要

    目的 研究西紅花苷-1對急性低氧條件下大鼠學習記憶及海馬區沉默信息調節因子1(SIRT1)表達的影響。方法 SD大鼠隨即分為5組:對照組,低氧模型組,西紅花苷-1低、中、高劑量(25、50、100 mg/kg)組。西紅花苷-1各組每天im給藥1次,給藥3 d后低氧環境下刺激72 h,采用Morris水迷宮觀察大鼠的學習記憶行為,免疫組化法與Western blotting法檢測大鼠海馬SIRT1蛋白表達。結果 與低氧模型組相比,西紅花苷-1各劑量使Morris水迷宮實驗中大鼠逃避潛伏期均明顯縮短,且穿越平臺次數增加(P<0.05)。免疫組化和Western blotting法檢測顯示,西紅花苷-1各組大鼠海馬組織SIRT1蛋白表達均顯著高于低氧模型組(P<0.05),其中以中、高劑量組作用明顯。結論 西紅花苷-1預先給藥,可增加急性低氧大鼠海馬組織SIRT1蛋白表達,這可能是其改善低氧條件下大鼠學習記憶的機制之一。

    英文摘要

    Objective To investigate the effect of crocin-1 on behavior of learning and memory in rats under acute hypoxia and on the expression of silent information regulator l (SIRT1) in hippocampus of rats. Methods SD rats were randomly divided into five groups: control, hypoxia model, low- , mid-, and high-dose (25, 50, and 100 mg/kg) crocin-1 groups. The SD rats in crocin-1 groups were im administered once daily for 3 d and then were stimulated for 72 h under hypoxia. Morris water maze was used to investigate the learning and memory behaviors. Immunohistochemical staining and Western blotting were used to detect the SIRT1 expression. Results The escape latency in crocin-1 groups was shorter than that in hypoxia model group, while the frequency of bestriding platform was increased (P < 0.05). Immunohistochemical staining and Western blotting both showed that the expression level of SIRT1 was higher in crocin-1 groups than that in hypoxia model group (P < 0.05), and the expression levels in mid- and high-dose groups were obviously higher. Conclusion Crocin-1 could increase the expression of SIRT1 in hippocampus of rats, which maybe one of the important mechanisms for crocin-1 improving learning and memory function of SD rats under acute hypoxia.

    針對高海拔低氧的特殊環境,機體的適應機制尤其是對缺血、缺氧敏感的腦海馬組織的適應性對機體非常重要。西紅花(又名藏紅花)Crocus sativus L. 中主要有效成分西紅花苷-1 具有預防動脈粥樣硬化、防治心血管疾病、抗氧化、治療腦梗塞和神經變性損壞等廣泛的藥理活性[1-2]。沉默信息調節因子1(silent information regulator l,SIRT1)是NAD+依賴的蛋白去乙酰化酶,在胚胎腦組織中的表達水平特別高,在成年大鼠腦皮質、海馬和小腦中也有表達,其調節細胞的許多功能,如基因修復、抗凋亡、抗應激、代謝等[3]。因此通過調節SIRT1 的表達可以降低細胞損傷、抑制細胞凋亡、抗氧化。從天然藥物和植物中開發SIRT1 激動劑是值得關注的課題。本實驗將西紅花苷-1 預先給予大鼠,觀察其對低氧條件下大鼠學習和記憶能力的影響及對腦海馬SIRT1 的調控作用。

    1 材料

    1.1 藥品與試劑

    西紅花苷-1,成都普瑞科技有限公司,批號C110113,質量分數≥97%;兔抗大鼠SIRT1 一抗,Santa Cruz Biotechnology 公司;兔抗大鼠SIRT1 二抗、辣根過氧化物酶顯色試劑盒(DAB),北京中杉金橋生物技術有限公司。

    1.2 動物

    雄性SD 大鼠,清潔級,體質量200~230 g,購于青海省地方病防治研究所實驗動物中心,合格證號:SCXK(青)2005-0001。

    1.3 儀器

    DMS-2 型Morris 水迷宮視頻跟蹤分析系統,中國醫學科學院藥物研究所;DYCZ-24DN 型雙垂直電泳槽、DYCP-40E 型半干轉移槽、DYY-7C 型電泳儀,北京市六一儀器廠;溫控搖床,美國New Brunswich 公司;化學發光型Micro Chemi凝膠成像系統,以色列DNR 公司。日本Olympus BX51 顯微鏡。

    2 方法

    2.1 分組與給藥

    30 只SD 大鼠稱質量,排序,采用隨機數字表將大鼠隨機分為5 組,每組6 只,分別為低海拔(2260m)對照組,低氧模型組(海拔4000m),西紅花苷-1 低、中、高劑量(25、50、100 mg/kg)組。在低氧刺激前3d 開始給藥(藥物用量為人用藥劑量的3 倍),每天im 給藥1 次,連續給藥3d,3d 后將大鼠運至青海省達日縣(海拔4000m)進行低氧刺激。

    2.2 Morris 水迷宮實驗

    大鼠于低氧刺激前3d 開始進行行為訓練,每天上午訓練3次,每次間隔30min。水迷宮為直徑160cm、高80cm 的圓形水池,水深50cm,水溫20~24 ℃,站臺高25cm,直徑8cm,置于某一象限內的固定位置,沒入水下2cm,迷宮外參照物保持固定。

    2.2.1 定位航行實驗 從站臺所處象限外的其他3個象限中隨機選擇一個入水點,將大鼠面向池壁放入池中,觀察并記錄大鼠尋找并爬上平臺的潛伏期。若60s 內找不到站臺,則將其放在站臺上15s 后再放回籠中,潛伏期記為60s。訓練時分別從3個不同的入水點入水。每天測試大鼠2次,每次間隔15min,連續訓練3d,記錄各組潛伏期。

    2.2.2 空間探索實驗 將池中站臺撤除,選定與站臺區域相對的象限的中點為入水點,記錄大鼠在2min 內在站臺所在象限探索的時間以及穿越平臺區的次數,以此評價大鼠的長時程空間記憶功能。

    2.3 免疫組化法檢測SIRT1 蛋白表達

    Morris 水迷宮實驗完成后,大鼠ip 10%水合氯醛(5mL/kg)麻醉,斷頭處死,快速取腦海馬組織置于4%多聚甲醛中固定,石蠟包埋,連續冠狀切片(3μm),切片常規脫蠟,蒸餾水沖洗,PBS 沖洗5min,共3次,用枸櫞酸鹽緩沖液(pH6.0)進行微波抗原修復,于新配制的0.3% H2O2 溶液中室溫下孵育10min 以滅活內源性過氧化物酶;PBS 沖洗5min,共3次,分別滴加兔抗大鼠一抗(1∶100)50μL,4 ℃孵育過夜,PBS沖洗,應用SP免疫組化檢測試劑盒進行免疫組化染色,DAB顯色。免疫組化陽性反應細胞呈棕黃色,應用Leica QWinV3圖像分析軟件,每張切片取2個400倍視野,測定每個視野的陽性細胞數,計算細胞總數及灰度值、陽性細胞的平均灰度值。

    2.4 Western blotting 法檢測SIRT1 蛋白表達

    提取大鼠腦海馬組織蛋白,用二辛可寧酸(BCA)法測定蛋白的量。取30μL 蛋白樣品上樣,聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE),電轉移1.5h至硝酸纖維素膜(NC)上,5%脫脂奶粉封閉2h后與1∶500稀釋的兔抗大鼠SIRT1 一抗于4 ℃過夜,與1∶10000稀釋的二抗室溫孵育30min,再與化學發光劑(ECL)室溫作用1min,曝光、顯影和定影。膠片掃描后,采用Quantity One 軟件對顯影條帶進行分析,以SIRT1 目的條帶與β-actin 條帶灰度的比值,作為SIRT1 蛋白的相對表達量。

    2.5 統計學處理

    運用SPSS11.5 進行統計學分析,多組間比較采用單因素方差分析,組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。

    3 結果

    3.1 對低氧刺激大鼠學習記憶的影響

    定位航行實驗顯示,與對照組大鼠的尋臺潛伏期(17.05±3.29)s 相比,模型組大鼠的尋臺潛伏期為(45.38±9.52)s,顯著延長(P<0.05)。與模型組相比,西紅花苷-1 低、中、高劑量組大鼠的尋臺潛伏期顯著縮短(P<0.05),分別為(32.83±4.32)、(17.85±2.01)、(16.81±3.61)s。

    空間探索實驗顯示,與對照組穿越平臺的次數10.17±1.47 相比,模型組大鼠穿越平臺次數明顯減少(P<0.05),為4.67±1.63。與模型組相比,西紅花苷-1 低、中、高劑量組大鼠穿越平臺的次數分別為7.50±1.22、10.33±1.37、11.17±2.40(P<0.05),表明西紅花苷-1 明顯改善經低氧刺激的大鼠對平臺位置的記憶能力。

    3.2 對大鼠海馬CA1 區SIRT1 表達的影響

    免疫組化法染色后顯微鏡觀察可見,對照組大鼠海馬CA1 區神經細胞中SIRT1 蛋白相對特異地、均勻地表達,表達位于胞漿和胞核內,以胞漿為主,細胞呈棕黃色著色。部分胞核中因SIRT1 蛋白表達,DAB 初染,蘇木素復染后,胞核并非呈藍色,而呈較深的棕黃色。與對照組比較,模型組大鼠海馬CA1區SIRT1 表達明顯下調(P<0.05)。與模型組比較,西紅花苷-1 各劑量組大鼠海馬CA1 區SIRT1 表達不同程度地上調(P<0.05),以中、高劑量作用更為顯著,而這兩組間差異不顯著。結果見圖1、表1。

    圖1 各組大鼠海馬CA1 區SIRT1 表達的免疫組化法檢測結果

    圖1 各組大鼠海馬CA1 區SIRT1 表達的免疫組化法檢測結果

     

    表1 西紅花苷-1 對低氧大鼠SIRT1 蛋白相對表達量的影響

    表1 西紅花苷-1 對低氧大鼠SIRT1 蛋白相對表達量的影響

    Western blotting 法檢測顯示,模型組大鼠海馬CA1 區SIRT1 蛋白相對表達量低于對照組(P<0.05)。與模型組相比,西紅花苷-1 各組大鼠海馬CA1 區SIRT1 表達均顯著上調(P<0.05),以中、高劑量組作用更明顯,但這兩組間差異不顯著。結果見圖2、表1。

    圖2 各組大鼠海馬CA1 區SIRT1 表達的Western blotting檢測結果

    圖2 各組大鼠海馬CA1 區SIRT1 表達的Western blotting檢測結果

    4 討論

    在高海拔低氧環境中,機體神經系統形態結構及功能會發生很大變化,而對缺血、缺氧最為敏感的海馬神經細胞則受到更大的影響。中樞神經系統的功能活動可通過學習記憶活動最直接表現出來,而腦海馬組織是人學習和記憶的關鍵部位。有研究表明,西紅花苷可提高慢性束縛應激模型大鼠的抗氧化酶活性,降低血漿中皮質酮水平,改善慢性應激誘導的學習與記憶損傷,減輕氧化應激對海馬區的損傷;還可以改善腦缺血大鼠的空間學習及記憶功能[4-5]。本實驗發現,低氧條件在影響大鼠學習和記憶的同時抑制海馬組織SIRT1 表達;西紅花苷-1預先給藥,明顯縮短大鼠在Morris 水迷宮實驗中潛伏期,增加穿越平臺的次數,以中、高劑量組的作用尤為明顯。表明西紅花苷-1 對大鼠腦海馬神經元功能具保護作用,從而顯著改善低氧應激對海馬組織學習記憶功能。

    SIRT1 在抗氧化應激、細胞能量代謝、DNA 損傷修復、抑制細胞凋亡及保護神經細胞等方面發揮重要調控作用[6-9]。本實驗發現,西紅花苷-1 組大鼠腦海馬組織中SIRT-1 表達比模型組顯著增加,以中、高劑量的作用尤為明顯,表明西紅花苷-1 對低氧應激后大鼠腦海馬組織中SIRT1 蛋白表達有上調作用。

    白藜蘆醇、漆樹黃酮、紫鉚因等天然產物均為SIRTl 激活劑,有較強的抗氧化、清除自由基作用,這些作用主要通過激活組蛋白去乙酰化酶的活性來發揮生物活性[10]。西紅花苷-1 對SIRT-1的表達的上調可能是其發揮在低氧應激下對大鼠神經保護作用的重要機制之一,但具體機制尚需進一步研究。

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    標簽:西紅花 西紅花苷 中草藥 科研 期刊

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